RESUMO: A geleia de Wharton é uma fonte de células tronco mesenquimais (CTMs) que ainda não havia sido testada para a produção de embriões bovinos por transferência nuclear (TN). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e testar as CTMs derivadas da geleia de Wharton para produção de embriões e gestações por transferência nuclear em bovinos. O cordão umbilical foi coletado durante o nascimento e as células derivadas da geleia de Wharton (CGWs) foram isoladas por explante e cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Medium. Fibroblastos (FB) da pele foram isolados após 6 meses de vida. As análises morfológicas foram realizadas pelas microscopias de campo claro e eletrônica de varredura durante o cultivo celular. Caracterização fenotípica e genotípica por citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e indução da diferenciação em linhagens celulares foi realizada com as CGWs. No procedimento de TN, ovócitos no estágio de metáfase II foram enucleados usando micromanipuladores, fusionados com CGWs ou FB e então ativados artificialmente. Micrografias de microscopia de varredura revelaram que CGWs tiveram forma variada sob cultivo. Os marcadores mesenquimais de CTMs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) foram expressos em cultura de CGWs bovina, como evidenciado por citometria de fluxo, imunocitoquímica e RT-PCR. Quando induzidas, estas células diferenciaram-se em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Após classificação, as CGWs foram utilizadas na TN. A taxa de formação de blastocistos por TN com CGWs no sétimo dia de cultivo foi de 25,80±0,03%, similar a produção de blastócitos por TN com fibroblastos de pele (19,00±0,07). Gestações foram obtidas e mostraram que CGWs constituem um novo tipo celular para ser usado na clonagem animal.

ABSTRACT: Wharton's jelly is a source of mesenchymal stem cells (MSCs) that had not yet been tested for bovine embryo production by nuclear transfer (NT). Thus, the objective of this study was to isolate, characterize and test MSCs derived from Wharton's jelly for embryo and pregnancy production by NT in cattle. The umbilical cord was collected during calving and cells derived from Wharton's jelly (WJCs) were isolated by explant and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium. Skin Fibroblasts (FB) were isolated after 6 months of life. Morphological analysis was performed by bright field and scanning electron microscopy (SEM) during cell culture. Phenotypic and genotypic characterization by flow cytometry, immunocytochemistry, RT-PCR and differentiation induction in cell lineages were performed for WJC. In the NT procedure, oocytes at the arrested metaphase II stage were enucleated using micromanipulators, fused with WJCs or FB and later activated artificially. SEM micrographs revealed that WJCs have variable shape under culture. Mesenchymal markers of MSCs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) were expressed in bovine-derived WJC cultures, as evidenced by flow cytometry, immunocytochemistry and RT-PCR. When induced, these cells differentiated into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. After classification, the WJCs were used in NT. Blastocyst formation rate by NT with WJCs at day 7 was 25.80±0.03%, similar to blatocyst rate with NT using skin fibroblasts (19.00±0.07%). Pregnancies were obtained and showed that WJCs constitute a new cell type for use in animal cloning.

O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência do sistema automatizado (curva de resfriamento controlada eletronicamente) de congelação de sêmen bovino versus o sistema convencional (curva não controlada) por meio dos parâmetros de qualidade e viabilidade espermática no período pós-descongelação. O sêmen de quatro touros azebuados adultos foram criopreservados simultaneamente em meio tris, gema e glicerol 7%. A avaliação computadorizada do sêmen descongelado detectou os seguintes parâmetros: MP 56,50±22,25%; VAP 34,77±4,25µm/s; VSL 28,17±4,25 µm/s; VCL 58,45±6,85µm/s; STR 82,00±2,31%; LIN 49,50±3,32%, para o sistema automatizado e MP. 57,00±13,11%; VAP 25,75±1,66µm/s; VSL 23,32±1,99µm/s; VCL 63,32±1,79µm/s; STR 82,25±3,59µm/s; LIN 50,00±4,97µm/s para o sistema convencional. Os valores médios das avaliações de integridade de membrana plasmática e integridade acrossomal foram de 54,72±12,55% e 36,13±22,20% para o sistema automatizado e 53,22±13,22% e 47,26±5,74% para o sistema convencional, respectivamente. Com os parâmetros avaliados foi possível identificar que não houve diferença estatística entre os sistemas de criopreservação. Desta forma, a escolha do método de criopreservação do sêmen bovino para utilização direta na propriedade fica a critério do técnico responsável, que deverá se basear na realidade de cada propriedade. Para tanto, sempre se deve considerar que o sistema convencional pode trazer mais variações que o sistema automatizado que, apesar do custo do equipamento, pode garantir repetibilidade nos resultados e consequente qualidade do sêmen bovino criopreservado.

The objective of this study was to compare the efficiency of bovine semen cryopreservation using the controlled-rate freezing machine versus the conventional method (uncontrolled curve) by the parameters of sperm quality and viability in post-thaw period. Semen from four adult crossbreed bulls was cryopreserved in Tris-yolk-glycerol medium. The computer assisted analysis of thawed semen detected the following results: PM 56.50±22.25%; VAP 34.77±4.25µm/s; VSL 28.17±4.25µm/s; VCL 58.45±6.85µm/s; STR 82.00±2.31%; LIN 49.50±3.32%, to automated system and PM 57.00±13.11%; VAP 25.75±1.66µm/s; VSL 23.32±1.99µm/s; VCL 63.32±1.79µm/s; STR 82.25±3.59µm/s; LIN 50.00±4.97µm/s to conventional cryopreservation system. The results of plasma membrane and acrosome integrity evaluation were 54.7±12.55% and 36.13±22.20% for the automated system and 53.22±13.22% and 47.26±5.74% for the conventional system, respectively. The parameters evaluated demonstrated that there was no statistical difference between the cryopreservation systems. Thus, the choice of the bovine semen cryopreservation method to be used on a farm is a responsibility of the technician, and should be based on the reality of each farm. Therefore, it is always necessary to consider that the conventional system of bovine semen cryopreservation can vary more than the automated system, which, despite the cost of the equipment, can ensure repeatability of the results and consequent quality of cryopreserved bovine semen.

O objetivo deste estudo foi avaliar as características morfológicas e funcionais dos espermatozóides bovinos recuperados de epidídimos resfriados por longos períodos e posteriormente criopreservados. Testículos bovinos foram coletados no abatedouro, transportados ao laboratório e armazenados a 5°C por 0, 24, 48 e 72 horas (n=10 para cada tratamento). Os espermatozóides foram extraídos de cada epidídimo, avaliados e diluídos em meio tris-gema-glicerol a 7% e criopreservados em nitrogênio líquido. As características morfológicas e funcionais dos espermatozóides foram avaliadas in vitro por análise microscópica e in vivo, por meio de inseminação artificial. Foram observadas alterações morfológicas características da imaturidade dos espermatozóides e redução da motilidade após 72 horas de refrigeração dos epidídimos. Esses parâmetros também foram alterados após o descongelamento, em todos os tratamentos. A manutenção dos espermatozoides a 5°C por 72h reduziu a motilidade espermática. Em todos os tratamentos foram observadas alterações morfológicas características da imaturidade dos espermatozoides e redução da motilidade após o descongelamento. A integridade de membrana plasmática e acrossoma somente foram afetadas pós criopreservação nos grupos mantidos a 5°C durante 48 ou 72h antes da criopreservação. Contudo, a capacidade de fecundação dos espermatozóides mantidos a 5°C durante 24 ou 72h antes da criopreservação foi suficiente para promover duas gestações e nascimento de bezerros saudáveis. Esses resultados indicam que a recuperação e a criopreservação de espermatozóides obtidos de epidídimos mantidos a 5°C, até 72h, provenientes de animais mortos é uma opção viável para preservar gametas masculinos para compor um banco de germoplasma.

The objective of this study was to evaluate the morphological and functional characteristics of bovine spermatozoa retrieved from chilled epidydimides for long periods and cryopreserved. Bovine testicles were collected in abattoir, transported to the laboratory and stored at 5°C for 0, 24, 48h e 72 hours (n=10 for each storage time treatment group). The spermatozoa were retrieved from each epidydimides, evaluated and diluted in tris-egg yolk-glycerol 7% medium and cryopreserved in liquid nitrogen. The morphological and functional characteristics of the spermatozoa were analyzed in vitro, by microscopic evaluation and in vivo, using artificial insemination. Morphological alterations as sperm immaturity and motility reduction decreased after 72h of epididymides refrigeration and after thaw sperm were observed. The membrane and acrosome integrity were only affected in G48 and G72 groups after cryopreservation. However, the sperm capacity of fertilization post-cryopreservation was sufficient to promote two pregnancies and birth of healthy calves from G24 h and G72h groups. These results indicated that recovery and cryopreservation of chilled epididymal sperm until 72h from dead animals is a viable option to preserve male gametes to compose a germplasm bank.

Os objetivos neste trabalho foram identificar e correlacionar parâmetros que caracterizem a puberdade e estimar a idade e o peso à puberdade de cordeiras mestiças Suffolk. Amostras de sangue de 22 borregas foram coletadas e centrifugadas e o plasma armazenado a -20 ºC para posterior análise das concentrações de progesterona (P4) por meio de radioimunoensaio. As medidas morfométricas aferidas foram: comprimento e largura da cabeça; comprimento do corpo; altura de cernelha; perímetro torácico; diâmetro dorso-esternal; comprimento, altura e largura de garupa; perímetro de canela; e largura entre ísquios e ílios, utilizando-se fita métrica. Definiu-se como início da puberdade quando os animais apresentaram concentração plasmática de P4 >1,0 ng/mL, o que ocorreu aos 34,1 ± 5,2 kg de peso vivo e 39,5 ± 8,5 semanas de idade. Entretanto, as cordeiras que não atingiram a puberdade (37,7 ± 11,4 semanas de idade) apresentaram peso menor. As medidas morfométricas apresentam médias e baixas correlações com idade e peso à puberdade.

The objective of this study was to identify and to correlate parameters that characterize puberty and estimate the age and weight of Suffolk ewe lambs in Mato Grosso do Sul. This study was carried out with twenty-two Suffolk ewe lambs for 256 days. Blood samples were collected from the jugular vein and centrifugated and the plasma were stored at -20°C until analysis of progesterone (P4) concentration by radioimmunoassay (RIA). The morphometric measurements included: head length and width, body length, elbow height, chest perimeter, back-sternal diameter, croup length, width and height, cannon bone perimeter and shoulder and hip width, using a tape. The animals became pubertal when the plasma progesterone concentration was >1.0 ng/mL, at 34.1 ± 5.2 kg and 39.5 ± 8.5 weeks of age. Meanwhile, the lambs that did not reach puberty (37.7 ± 11.4 weeks of age) were lighter. The morphometric measurements has medium to low correlations with age and weight at puberty.